FIVET (fertilizzazione in vitro con embryo transfer) ed ICSI (Intracytoplasmatic Sperm Injection)

FIVET (fertilizzazione in vitro con embryo transfer) ed ICSI (Intracytoplasmatic Sperm Injection)

Nel 1968 Robert Edwards biologo ed embriologo inglese, , padre della fecondazione in provetta e  vincitore nel 2010 del premio Nobel per la medicina  riesce a ottenere la fertilizzazione di un ovulo umano in laboratorio.

Dieci anni dopo nel 1978, mise a punto, insieme al chirurgo e ginecologo Patrick Steptoe, la tecnica FIVET (fertilizzazione in vitro con embryo transfer) nella clinica Bourn Hall di Cambridge.

Grazie a tale tecnica, in quell’ anno nell’ Oldham General Hospital nacque Louise Brown la prima bambina in provetta, oggi mamma a sua volta di un bambino. Nel nostro Paese il primo parto dopo FIVET risale al 1983. Si stima che tale tecnica ad oggi abbia permesso la nascita di milioni di bimbi in tutto il mondo.

Con il termine di fecondazione in vitro  si intende la fecondazione della cellula uovo da parte degli spermatozoi al di fuori dell’organismo.

Nella FIVET, gli spermatozoi a volte non riescono a fertlizzare l’ovocita anche se vengono posti nella immediata prossimità dell’ovocita. Nacque allora la SU.Z.I. o inseminazione al di sotto della zona pellucida  (subzonal insemination) una tecnica ormai dimenticata ma che é stata la progenitrice della attuale ICSI.

La prima pubblicazione sulla SU.Z.I. é del 1990 e comunica la prima nascita al mondo di due gemelli da micromanipolazione dei gameti e  può essere considerata come la prima nascita da tecnica di riproduzione assistita con micromanipolazione dei gameti,  al mondo.

La ICSI o iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo nasce nel 1992.

Essa è il frutto del caso o dell’errore di un biologo il quale durante le manovre di manipolazione per l inserimento dello spermatozoo al di sotto della zona pellucida dell’ ovocita (SUZI)) fece penetrare uno spermatozoo nel citoplasma dell’ovulo che in questo modo si fecondò.

Questo metodo dal 1992, anno della sua applicazione ha conosciuto un crescente successo negli ultimi anni e consente di ottenere una  gravidanza in coppie infertili per cause maschili per le quali in precedenza non esisteva alcuna soluzione medica a eccezione del dono di sperma, e inoltre le percentuali di successo sono più elevate per una ICSI che per una FIVET tradizionale.

Queste tecniche, si utilizzano quando sono falliti i precedenti tentativi, come l’ Inseminazione Intra Uterina (IUI). Inoltre, è la soluzione ai problemi di sterilità derivati dal fattore maschile e dal fattore tubarico (tube di Falloppio ostruite).

L’ iniezione Intracitoplasmatica degli Spermatozoi inizialmente indicata in casi di fattore di sterilità maschile grave, situazioni in cui disponiamo di un numero limitato di ovociti, attualmente è divenuta la tecnica di gran lunga più utilizzata nella PMA di secondo livello.

Il procedimento sia per la FIVET che per la ICSI è in parte comune ed è composto da varie fasi:

  •  Valutazione personalizzata della paziente.  miglior trattamento per ogni problema d’infertilità (anamnesi, massa corporea, riserva ovarica, ecc.)
  • Stimolazione ovarica. Questo procedimento è necessario per incrementare le possibilità di successo, poiché la donna, in modo naturale, produce solo un follicolo e, pertanto, un ovocita ad ogni ciclo mestruale. Questo trattamento cerca di stimolare l’ovario affinché produca più ovociti di quanto farebbe naturalmente in modo da poter ottenere un numero maggiore di embrioni.
  • Monitoraggio della  stimolazione ovarica controllata . La terapia di induzione della crescita follicolare multipla  dura da 10 a 14 giorni. Dopo qualche giorno di terapia, la crescita follicolare viene attentamente sorvegliata mediante dosaggio serico del 17 beta estradiolo ed ecografie. Hanno il fine di personalizzare la terapia adeguandola all’entità della risposta ovarica ottenuta.

Monitoraggio ecografico follicolare. Il monitoraggio ecografico dello sviluppo follicolare, avviene mediante l’utilizzo di un ecografo dotato di sonda trans-vaginale, generalmente a giorni alterni o anche se necessario quotidianamente.

La valutazione della rima endometriale indica non solo una sincronia con la funzione ovarica ma permette di ipotizzare la riuscita di un eventuale impianto. Il monitoraggio follicolare è dunque finalizzato sia ad ottenere il recupero di un numero ottimale di ovociti, sia a prevenire, per quanto possibile, la comparsa di condizioni potenzialmente rischiose per la salute della donna come l iperstimolazione ovarica. La situazione può essere molto diversa da paziente a paziente e anche da ciclo a ciclo per la stessa paziente, dunque non c’è un numero ottimale di follicoli o un livello preciso di estradiolo: 4 follicoli possono essere un ottimo risultato per una paziente di 42 anni con l’FSH alto e un pessimo risultato per una donna di 25 anni con l’FSH basso. In linea generale una buona risposta alla stimolazione potrebbe consistere nell’ottenere 10 follicoli di almeno 20 mm di diametro, con un valore di estradiolo di circa 2000 pmol/l (ci si aspetta di trovare circa 200 pmol/l di estradiolo per ciascun follicolo maturo).

Quando lo sviluppo dei follicoli e l’aumento del 17 beta estradiolo fanno ritenere che un numero soddisfacente di ovociti abbia raggiunto un’adeguata maturazione, viene programmato il prelievo ecoguidato degli ovociti  o Pick-up ovocitario ecoguidato o prelievo follicolare. Esso viene eseguito circa 36 ore dopo aver somministrato l ’iniezione di hCG che provoca la maturazione finale degli ovociti. Il prelievo degli ovociti consiste nel prelevare gli ovociti dai follicoli ovarici in modo da poterli poi fecondare in vitro. Esso si esegue per via transvaginale.

Un ago sottilissimo sulla guida posta sulla sonda ecografica transvaginale, permette attraverso la parete vaginale  di raggiungere i follicoli e se ne aspira il liquido. Quest’ultimo viene raccolto in una provetta e inviato subito in laboratorio, dove viene controllato al microscopio per cercare gli ovociti . L’intera procedura dura alcuni minuti, a seconda della quantità di follicoli da aspirare. Il pick-up può essere fatto in anestesia locale o in sedazione generale. L’anestesia locale consiste in una iniezione di anestetico sul collo dell’utero. Dopo il pick-up la paziente viene tenuta in osservazione per qualche ora, per controllare che non ci siano complicazioni e, se ha fatto la sedazione generale, per assicurarsi che abbia riacquistato un buon livello di coscienza. Solitamente la dimissione dal centro avviene 2-3 ore dopo il pick-up.

Subito dopo il pick-up gli ovociti vengono esaminati per valutarne lo stadio di maturazione. Infatti per poter essere fecondato l’ovocita deve trovarsi in una precisa fase di maturazione : la metafase II. Dopo il primo esame gli ovociti vengono messi in coltura in un apposito liquido e poi incubati in  termostato a CO2 . Nel frattempo il partner maschile produrrà tramite masturbazione un campione di liquido seminale. Nei casi di azoospermia è possibile recuperare gli spermatozoi direttamente dai testicoli, congelarli ed utilizzarli al momento opportuno. Una volta ottenuto il campione, il liquido seminale viene esaminato per controllarne la qualità e per prepararlo alla fecondazione. Il processo di fecondazione si può realizzare con una FIVET oppure con una ICSI.

Nel primo caso si colloca nella piastra di coltura un ovocita circondato da spermatozoi per 16-20 ore, dopodiché  le uova vengono controllate per accertare se sia avvenuta la fertilizzazione solo dopo la creazione dello zigote verranno reimmessi nella paziente.

Requisiti di ammissione:

Danno tubarico irreversibile

Fattore maschile

Endometriosi

Sterilità inspiegata

Nella ICSI invece si introduce mediante il microscopio micromanipolatore lo spermatozoo direttamente nel citoplasma dell’ ovocita iniettandolo al suo interno.

La straordinaria novità apportata dalla ICSI allintero settore della procreazione medicalmente assistita (PMA) risiederebbe nel modo di valorizzare la capacità fecondante di un individuo, non più sulla base di un confronto tra una concentrazione nemaspermatica, più o meno mobile, con uno o più ovociti, ma semplicemente tra un singolo spermatozoo e una cellula uovo matura. In altri termini, grazie alla ICSI è oggi possibile parlare di potenzialità fecondante in quei soggetti fino a qualche anno fa ritenuti assolutamente sterili perché affetti da azoospermia non-ostruttiva .

Nei casi in cui non siano evidenziabili spermatozoi nel liquido seminale a causa di patologie ostruttive dei dotti deferenti, è possibile prelevare spermatozoi dall’epididimo (MESA = Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration)ed utilizzarli per la metodica ICSI. Se non fossero presenti spermatozoi nemmeno nell’epididimo c’è la possibilità di prelevare gli spermatozoi direttamente dal testicolo (TESE = Testicular Sperm Extraction). Queste procedure sono eseguibili ambulatorialmente ed in anestesia locale.

Le percentuali di fecondazione non sono mai del  100%: nelle donne più giovani la percentuale può essere dell’80%, ma in media è del 60% e, nelle donne meno giovani, può non superare il 30%.

Sia con la FIVET che con la ICSI dopo la fecondazione si procede alla coltivazione degli embrioni in laboratorio. Gli embrioni ottenuti vengono osservati in laboratorio giorno dopo giorno e vengono classificati secondo la morfologia e la capacità di divisione. Alcuni embrioni possono arrestarsi durante il loro sviluppo e saranno perciò eliminati. Il controllo dell’avvenuta fecondazione avviene  16-20 ore dopo l’incontro dei due gameti. Se c’è stata la fecondazione dentro l’ovocita sono visibili i due pronuclei quello femminile e  quello maschile. A questo punto non si parla più di ovocita ma di zigote.

  • Trasferimento embrionale. Consiste nell’introduzione nell’utero da due a cinque giorni dopo che gli ovociti sono stati fertilizzati, degli embrioni migliori tra quelli ottenuti in laboratorio, tramite un sottile catetere ed attraverso il canale cervicale dopo aver posizionato lo speculum. Non è necessaria l’anestesia essendo un processo rapido e indolore.

Gli embrioni possono essere trasferiti nell’utero a vari stadi del loro sviluppo. La maggior parte dei centri li trasferisce quando sono allo stadio di 4-6-8 cellule, dunque il transfer avverrà al 2° o al 3° giorno dopo il pick-up (ad esempio se il pick-up è avvenuto di domenica il transfer avverrà il martedì o il mercoledì). Se si è deciso di portare gli embrioni allo stadio di blastocisti il transfer avverrà al 5° giorno dopo il pick-up . Se viene fatta una biopsia della blastocisti, il transfer avviene in un ciclo successivo, dopo averlo vitrificato per attendere i risultati degli esami genetici.

Gli zigoti si sviluppano secondo un percorso ben preciso. Anzitutto i due pronuclei si fondono in un unico nucleo che conterrà 46 cromosomi, 23 da parte della paziente e 23 da parte dell’uomo; poi la nuova cellula comincia a dividersi con un ritmo intenso, che la porta in pochi giorni a superare il centinaio di cellule:

  • circa 48 ore dopo la fecondazione, cioè il 2° giorno dopo il pick-up, l’embrione è formato da almeno 4 cellule
  • circa 72 ore dopo la fecondazione, cioè il 3° giorno dopo il pick-up, l’embrione è formato da almeno 8 cellule; in questa fase lo zigote si chiama morula
  • al 4° giorno dopo la fecondazione l’embrione raggiunge lo stadio chiamato morula compatta: è formato da 16-32 cellule ed al suo interno inizia a formarsi la cavità blastocistica
  • al 5° giorno dopo la fecondazione l’embrione diventa una blastocisti:. Le sue cellule, 32-64, smettono di essere totipotenti e iniziano a dividersi in uno strato esterno, che formerà la placenta, e in uno strato interno, dal quale si svilupperà l’embrione
  • al 6°-7° giorno dopo la fecondazione la blastocisti inizia a impiantarsi nell’utero. Non è un evento istantaneo ma un processo complesso che si concluderà circa 14 giorni dopo la fecondazione: a quel punto la gravidanza sarà iniziata.

Quanto al numero di embrioni da trasferire, la scelta dipende da molti fattori, tra cui la qualità degli embrioni e l’età della paziente. Il principio generale è trovare una via di mezzo tra il desiderio di ottenere una gravidanza e la necessità di evitare una gravidanza plurigemellare: trasferire più embrioni significa aumentare la probabilità di una gravidanza ma anche il rischio di una gravidanza multipla, molto pericolosa per la donna e per i feti. Il transfer è una procedura semplice e quasi sempre totalmente indolore, simile a una inseminazione intrauterina. Gli embrioni vengono aspirati, insieme a una piccola quantità di liquido di coltura, in un sottile catetere, che viene inserito nel canale cervicale fino ad arrivare nell’utero, dove  vengono depositati sull’endometrio.

Transfer embrionale

Dopo il transfer la paziente rimane stesa per circa mezz’ora e successivamente viene dimessa con la raccomandazione di stare a riposo per il resto della giornata e nei giorni seguenti. Sulla necessità del riposo (parziale o assoluto) dopo i transfer esistono opinioni discordanti.

Si discute molto  su quale sia il comportamento e la terapia da seguire nei giorni dopo il transfer: bisogna osservare particolari regole di vita o si può fare una vita normale? Bisogna assumere dei farmaci per aiutare l’impianto degli embrioni? Riguardo alla regole di vita generali ci sono opinioni molto diverse. Alcuni ginecologi  consigliano di passare immobili a letto i primi giorni dopo il transfer e, nei giorni successivi, di evitare quasi qualunque attività; altri invece sostengono che il riposo o l’immobilità non aumentano le probabilità di una gravidanza e che si tratta di precauzioni del tutto inutili. Gli argomenti a sostegno dell’una o dell’altra ipotesi sono più di buon senso che scientifici. Da un lato si sostiene che è meglio esagerare in prudenza ed evitare qualunque comportamento che possa anche solo lontanamente influire in negativo sull’esito del trattamento; dall’altro si sostiene che nei concepimenti naturali nessuna donna sta a riposo dopo la fecondazione e che dunque non c’è necessità che lo facciano le donne sottoposte a FIVET.

Ecco alcune cose che di solito i ginecologi consigliano di evitare dopo il transfer:

1) evitare di avere rapporti sessuali e orgasmi

2) evitare di sollevare pesi

3) evitare attività faticose, incluse le pulizie domestiche

4) evitare attività che comportano salti e vibrazioni (aerobica, automobile)

5) evitare di esporsi al calore (saune, bagni caldi, esposizione al sole)

6) evitare fumo, caffeina, alcol e droghe

Tenete conto inoltre che l’impianto non avviene subito dopo il transfer ma nei giorni successivi: sia nella fecondazione naturale che in quella in vitro, l’embrione inizia a impiantarsi nell’endometrio solo a partire dal 5°-6° giorno dopo la fecondazione, con un processo complesso e che non è istantaneo ma dura vari giorni. Dunque non ha molto senso far stare a letto la paziente il giorno dopo il transfer e poi ricominciare la vita di sempre. Anche per quanto riguarda le terapie di sostegno non c’è un’opinione condivisa da tutti i medici. Alcuni ritengono che sia inutile somministrare farmaci e che il motivo delle terapie post-transfer sia più di ordine psicologico che di ordine clinico. Tuttavia, per un motivo o per l’altro, quasi tutti i medici prescrivono nella fase post-transfer alcuni farmaci che dovrebbero aumentare le probabilità di impianto degli embrioni. Il farmaco più spesso prescritto è il progesterone per vaginale. A volte al progesterone soprattutto nei casi in cui cè un problema immunitario, si associano  antiaggreganti (ac. acetilsalicilico, eparine a basso peso molecolare) e cortisonici. Qualunque farmaco prescritto deve essere continuato fino al momento del test di gravidanza ed eventualmente anche oltre, se il test sarà positivo. 

Vitrificazione degli embrioni sovrannumerari. Una volta realizzato il trasferimento embrionale, gli embrioni in più ottenuti in quel ciclo di PMA possono essere conservati attraverso il congelamento o la più recente tecnica di  congelamento rapido detta vitrificazione che pare essere meno traumatica per gli embrioni. In tal modo le coppie avranno un’altra probabilità di realizzare una gravidanza. Ciò può essere una interessante opportunità  per quelle coppie che non ottengono la gravidanza durante il ciclo iniziale o anche per quelle coppie che, ottenuto il primo figlio, desiderano averne un secondo in futuro.  Gli embrioni potranno così essere trasferiti in un ciclo successivo senza la necessità di stimolazione ovarica.

  • Test di gravidanza. Circa 2 settimane dopo il trasferimento embrionale, la paziente eseguirà  un prelievo di sangue per il dosaggio della beta-hCG (ormone della gravidanza). Se la prova risultasse positiva, si dovrà eseguire un’ecografia vaginale una settimana dopo per visualizzare il sacco gestazionale. La maggior parte delle prove rivelano risultati decisamente positivi o negativi; tuttavia, occasionalmente ci sono risultati “debolmente positivi. Questa situazione può essere causata da uno dei seguenti fattori :

* Normale ma ritardato impianto dell’embrione

* Gravidanza interrotta

* Gravidanza Extra-uterina

* Errore di laboratorio

Un ulteriore controllo della beta-hCG si rende necessario nelle suddette situazioni due giorni dopo.  Il livello dell’ hCG tende a raddoppiarsi ogni due tre giorni.

Il momento più difficile, psicologicamente, dell’intera terapia. La maggior parte dei medici chiede che il test sia fatto 12 o 14 giorni dopo il transfer. Spesso le donne non resistono così a lungo e anticipano il test all’ 11° o al 10° giorno dopo il transfer; in questo caso, se il test viene negativo, va ripetuto nei giorni seguenti. Alcuni centri chiedono di fare il primo test 12 giorni dopo il transfer e di ripeterlo comunque al 14°, per maggior sicurezza.  Il test deve sempre consistere in un dosaggio della betahCG nel sangue. Infatti in questa fase così precoce della gravidanza la quantità di betahCG può essere troppo bassa per essere rilevata dai test urinari, anche da quelli più sensibili. Il dosaggio dell’hCG deve essere quantitativo, non qualitativo, perché anche una piccola quantità di hCG può rappresentare un risultato utile da conoscere: un valore molto basso che in un dosaggio qualitativo significherebbe risultato negativo  indica probabilmente una gravidanza biochimica destinata purtroppo a concludersi con un aborto, ma è comunque importante sapere che qualcosa è successo.

Giuseppe Nicodemo
giunico@hotmail.com
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